BAB 1
LATAR BELAKANG
Konsep gen berkembang setelah penemuan mendel tentang segregasi dan pemisahan dan pengelompokan bebas. Gen diduga mempunyai beberapa sifat khusus yaitu: (1) satu unit keturunan yang diwariskan dari genetika ke generasi berikutnya, (2) suatu unit fungsional yang menghasilkn suatu fenotipe, (3) suatu aspek fungsional yang menyebabkan duplikasi sendiri (sel duplication).
Dengan perkembangan prinsip genetika dasar dan macam-macam pola pewarisan, maka timbul pertanyaan-pertanyaan.apa yang diwariskan? Gen tersusun dari apa dan bagaimana gen-gen itu mengatur dan menampakan pemgaruh yang kita lihat?
Pengetahuan tentang pengaturan asam deoksiribonukleat (ADN) didalam kromosom dapat membantu kita untuk mengerti bagaimna gen dan mengatur sintesis protein. Juga akan memperjelas perubahan komposisi gen karena mutasi.
ADN mengandung informasi genetik dalam bentuk kode. Kode ini telah di terjemahkan dalam suatu model yang menggamabarkan bagai mana informasi tersebut berlangsung dari ADN dalam gen sampai pada protein dalam sel hidup.
Geneika merupakan salah satu ilmu pengetahuan alam yang sangat menarik, karena disamping orang ingin mengetahui segala ihwal mengenai keturunan. Menyediakan bibit tanaman dan ternak unggul dibidang pertanian dan peternakan. Orang juga ingi mengetahui pulah rahasia dirinya sendiri.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Perbedaan Antara ADN, ARN, Kromosom, DNA dan Sel
ADN (asam deoksiribonukleat) adalah bahan yang diwariskan dan merupakan unsur pokok kromosom yang disebut nuklein atau bahan yang ada hubungannya dengan nukleus. Miescher seorang ahli Fisika dari swiss, dalam tahun 1871 melihat adanya endapan dari inti nanah karena mudah didapat pada kain pembalut luka dan mengandung sel darah putih (sel yang paling sederhana) kemudian ia mengunakan sperma ikan salmon yang hanya terdiri dari nukleus dan sedikit sitoplasma. Beberapa tahun kemudian E.B. Wilson menyatakan bahwa asam nuekleat adalah bahan kuturunan, tetapi bukti-bukti belum ada selama setengah abad. Hertwig dalam tahun 1884 menyatakan bahwa nuklein ada hubungannya dengan pembuahan dan pewarisan sifat-sifat keturunan.
1. ADN dan Kromosom
a. Reaksi pewarna Feulgen (dikembangkan sekitar tahun 1920) Zat pewarna ini khususnya untuk ADN dan kromosomsangat mudah menyerap. Jumlah noda bewarna dapat di ukur dengan fotometer (jumlah sinar yang diserap apabila sel yang telah dicat diletakkan pada mikroskop dan sinarnya di arahkan pada sutu initi tunggal).
a. Sinar Ultra Violet dan ADN Ultra violet dapat menyebabkan mutasi pada kekuatan 2600 A0. Ini sesuai dengan penyerapan maksimum ultra violet oleh ADN. Sebaliknya protein hanya menyerap sedikit pada 2600 A0.
b. Transformasi Bakteri dan ADN Dalam Kromosom Tikus Dalam tahun 1928 Griffith melkukan percobaan dengan memakai dua galur (strain) Diplococcus pneumoniae yang menjangkiti tikus. Salah satu tipe disebut tipe kasar (R = Avirulen) bila disuntikan pada tikus menyebabkan tikus sakit tetapi tidak mati. Tipe lain yang disebut dengan tipe halus (S = Virulen) menyebabkan septisema dan kematian pada tikus. Apabila galur S dapat di isolasi. Perlu bahan tipe ini disebut transformasi karena ada pertukaran ADN.
c. Hershey dan chase melakukan percobaan dengan bakteriphage dan bakteria (E. Coli) dalam tahun 1952. Mereka berpendapat bahwa ADN adalah substansi gen yang aktif bukan kumpulan pecahan protein gen seperti yang telah dinytakan sebelumnya. Percobaan klasic ini diuraikan jelas dalam pustaka dan saudara supaya membaca dan mengerti maksudnya.
BAB III
BAHAN GENETIKA
A. Dasar Pikiran
Konsep gen berkembang setelah penemuan mendel tentang segregasi dan pemisahan dan pengelompokan bebas. Gen diduga mempunyai beberapa sifat khusus yaitu: (1) satu unit keturunan yang diwariskan dari genetika ke generasi berikutnya, (2) suatu unit fungsional yang menghasilkn suatu fenotipe, (3) suatu aspek fungsional yang menyebabkan duplikasi sendiri (sel duplication).
Dengan perkembangan prinsip genetika dasar dan macam-macam pola pewarisan, maka timbul pertanyaan-pertanyaan.apa yang diwariskan Gen tersusun dari apa dan bagaimana gen-gen itu mengatur dan menampakan pemgaruh yang kita lihat
Pengetahuan tentang pengaturan asam deoksiribonukleat (ADN) didalam kromosom dapat membantu kita untuk mengerti bagaimana gen dan mengatur sintesis protein. Juga akan memperjelas perubahan komposisi gen karena mutasi.
ADN mengandung informasi genetik dalam bentuk kode. Kode ini telah di terjemahkan dalam suatu model yang menggamabarkan bagai mana informasi tersebut berlangsung dari ADN dalam gen sampai pada protein dalam sel hidup.
Gen sesuai dengan daerah dalam DNA, molekul terdiri dari rantai empat jenis nukleotida-urutan nukleotida ini adalah informasi genetik organisme mewarisi.
DNA alami terjadi dalam bentuk yang terdampar ganda, dengan nukleotida pada setiap untai komplementer satu sama lain. Setiap untai dapat bertindak sebagai template untuk membuat sebuah mitra baru untai-ini adalah metode fisik untuk membuat salinan dari gen yang dapat diwariskan.
Urutan nukleotida dalam gen diterjemahkan oleh sel untuk menghasilkan rantai asam amino, menciptakan protein-urutan asam amino dalam protein sesuai dengan urutan nukleotida dalam gen. Hubungan antara urutan nukleotida dan urutan asam amino yang dikenal sebagai kode genetik. Asam amino dalam protein menentukan bagaimana lipatan menjadi bentuk tiga-dimensi struktur ini, pada gilirannya, yang bertanggung jawab untuk fungsi protein tersebut. Protein melaksanakan hampir semua fungsi yang diperlukan untuk sel untuk hidup. Sebuah perubahan DNA pada gen yang dapat mengubah asam amino protein, mengubah bentuk dan fungsi: ini dapat memiliki efek dramatis dalam sel dan pada organisme secara keseluruhan. Meskipun genetika memainkan peran besar dalam tampilan dan perilaku organisme, itu adalah kombinasi dari genetika dengan apa sebuah pengalaman organisme yang menentukan hasil akhir. Sebagai contoh, sementara gen memainkan peran dalam menentukan ukuran suatu organisme, nutrisi dan kondisi lain pengalaman setelah awal juga memiliki efek yang besar.
Urutan nukleotida dalam gen diterjemahkan oleh sel untuk menghasilkan rantai asam amino, menciptakan protein-urutan asam amino dalam protein sesuai dengan urutan nukleotida dalam gen. Hubungan antara urutan nukleotida dan urutan asam amino yang dikenal sebagai kode genetik. Asam amino dalam protein menentukan bagaimana lipatan menjadi bentuk tiga-dimensi struktur ini, pada gilirannya, yang bertanggung jawab untuk fungsi protein tersebut. Protein melaksanakan hampir semua fungsi yang diperlukan untuk sel untuk hidup. Sebuah perubahan DNA pada gen yang dapat mengubah asam amino protein, mengubah bentuk dan fungsi: ini dapat memiliki efek dramatis dalam sel dan pada organisme secara keseluruhan. Meskipun genetika memainkan peran besar dalam tampilan dan perilaku organisme, itu adalah kombinasi dari genetika dengan apa sebuah pengalaman organisme yang menentukan hasil akhir. Sebagai contoh, sementara gen memainkan peran dalam menentukan ukuran suatu organisme, nutrisi dan kondisi lain pengalaman setelah awal juga memiliki efek yang besar.
B. Perbedaan Antara ADN, ARN, Kromosom, DNA dan Sel
ADN (asam deoksiribonukleat) adalah bahan yang diwariskan dan merupakan unsur pokok kromosom yang disebut nuklein atau bahan yang ada hubungannya dengan nukleus. Miescher seorang ahli Fisika dari swiss, dalam tahun 1871 melihat adanya endapan dari inti nanah karena mudah didapat pada kain pembalut luka dan mengandung sel darah putih (sel yang paling sederhana) kemudian ia mengunakan sperma ikan salmon yang hanya terdiri dari nukleus dan sedikit sitoplasma. Juga ikan salmon ini terdapat di dalam sungai Rhine yang letaknya dekat. Hasil analisis kimia menunjukkan bahwa endapan tersebut terdiri dari fosfor dan nitrogen. Sebenarnya Miescher telah menemukan gugus ADN protein tetapi tidak mengetahuinya.
Beberapa tahun kemudian E.B. Wilson menyatakan bahwa asam nuekleat adalah bahan kuturunan, tetapi bukti-bukti belum ada selama setengah abad. Hertwig dalam tahun 1884 menyatakan bahwa nuklein ada hubungannya dengan pembuahan dan pewarisan sifat-sifat keturunan.
1. ADN dan Kromosom
ADN terdapat hampir seluruhnya dalam kromosom organisme tingkat tinggi. ADN dalam sel diploid untuk semua organisme pada dasarnya sama dan jumlahnya berubah-ubah dengan adanya replikasi kromosom. Jumlah dan jenis protein di dalam sel diploid dan sel haploud berubah-ubah tidak tergantung pada jumlah kromosom.
a. Reaksi pewarna Feulgen (dikembangkan sekitar tahun 1920)
Zat pewarna ini khususnya untuk ADN dan kromosomsangat mudah menyerap. Jumlah noda bewarna dapat di ukur dengan fotometer (jumlah sinar yang diserap apabila sel yang telah dicat diletakkan pada mikroskop dan sinarnya di arahkan pada sutu initi tunggal). Inti-inti dari gamet menyerap sinar sebanyak ½ dari jumlah sinar yang di serap oleh sel somatik.
b. Sinar Ultra Violet dan ADN
Ultra violet dapat menyebabkan mutasi pada kekuatan 2600 A0. Ini sesuai dengan penyerapan maksimum ultra violet oleh ADN. Sebaliknya protein hanya menyerap sedikit pada 2600 A0.
c. Transformasi Bakteri dan ADN Dalam Kromosom Tikus
Dalam tahun 1928 Griffith melkukan percobaan dengan memakai dua galur (strain) Diplococcus pneumoniae yang menjangkiti tikus. Salah satu tipe disebut tipe kasar (R = Avirulen) bila disuntikan pada tikus menyebabkan tikus sakit tetapi tidak mati. Tipe lain yang disebut dengan tipe halus (S = Virulen) menyebabkan septisema dan kematian pada tikus. Apabila galur S dapat di isolasi. Perlu bahan tipe ini disebut transformasi karena ada pertukaran ADN.
Catatan : laporan percobaan griffith ini terdapat dalam satu pustaka dan sayudara supaya mengetahui informasi-informsi yang ada didalamnya.
d. Aktifitas ADN dalam Virus
Hershey dan chase melakukan percobaan dengan bakteriphage dan bakteria (E. Coli) dalam tahun 1952. Mereka berpendapat bahwa ADN adalah substansi gen yang aktif bukan kumpulan pecahan protein gen seperti yang telah dinytakan sebelumnya. Percobaan klasic ini diuraikan jelas dalam pustaka dan saudara supaya membaca dan mengerti maksudnya.
2. ARN sebagai Bahan Keturunan
Asam ribo nokleat adalah satu perkecualian bahwa ADN adalah satu-satunya bahan keturunan. Pada beberapa virus, ARN mengantikan ADN sebagai bahan genetik
3. ARN (Asam Ribo Nukleat)
Dua tipe asam nuklet telah diketemukan setelah di ketahui bahwa asam ini merupakan dasar dari bahn keturunan. ADN terdapat hampir seluruhnya dalam inti dan ARN terdapat dalam inti dan sitoplasma.
ARN biasanya terdiri dari satu pita (strand) sedang ADN terdiri dari pita rangkap. ARN mengandung ribosa dan ADN mengndung deoksiribosa. Pada kedudukan C yan kedua, deoksi ribosa kekurangan satu oksigen. ARN mengandung pirimidin Urasil (U) bukan timin. Molekul ARN biasanya lebih pendek dari pada molekul ADN. Fungsi ARN terutama dalam sintesis protein dan ada tiga tipe ARN.
4. Struktur FisikDari ADN
Bentuk spiral ganda (double helix) menurut Watson-crick diumumkan pada tahn 1953.
Catatan: makalah Watson dan Crick adalah bacaan wajib.
a. Mereka mengusulkan bentuk spiralganda yang terikat menjadi satu olah ikat hidrogen antara basa yang berpasangan sebagai A-T dan G-S
b. Pola difraksi ADN oleh sina X. Wilkins dan franklin pada tahun 1950 melaporkan bahwa bagian ADN ( nukleutida) tesusun dengan konfigurasi tepat dan dengan interval tetap dalam molekul itu.
c. Pauling menduga bahwa molekul terdiri dari tiga pita dengan ikatan gula-fosfat ditengah,tetapi disanggah oleh watson dan crick.
d. Model watson dan crick menggunakan informasi dari peneliti lain yaitu perbandingan 1.1 antara A=T, G=S, dari Chargaff, model tiga pita dari pauling dan di fraksi sinar X dari wilkins dan franklin.
e. Kita sekarang tau bahwa ADN terdiri dari pita polinukleotida yang panjang dan saling membelit sehingga membentuk spiral ganda (double ganda).
5. Replikasi ADN
Watson dan Crick mengusulkan bahwa replikasi terjadi karena putusnya ikatan hidrogen yang menghubungkan pasangan-pasngan basa dengan terlepasnya kedua Pita ADN dan terbentuk pita komplemennya.
6. Metode Replikasi
a. Replikasi semi konservatif – terjadi pemisahan spiral ganda (duplex) menjadi dua pita pada daerah tertentu dengan jarak yang pendek. Akibatnya kedua pita mempunyai nukleotida yang tidak berpasangan. Nukleotida yang terdapat pada sel akan tetarik pada basa yang sesuai dalam molekul ADN.
b. Replikasi konservasif – pasangan pita lama tetap tak berubah dan terbentuk molekul ADN yang terdiri dari dua pita baru. Molekul anak tidak mengandung bagian dari molekul ADN asli.
c. Replikasi disfersif – pasangan pita lama terputus menjadi beberapa bagian, krudian mengganda dan pada generasi berikutnya ADN akan terdiri dari bagian lama dan baru yang letaknya terseber pada pita ADN.
7. Bukti Adanya Replicasi Semi Konservatif
Autoradiogram dari kromosom Vicia faba digunakan untuk memasikan tipe replicasi ADN. Timidin radioaktif dimasukkan di dalam ADN selam repliskaikromosomdengan jalan menumbuhkan akar vicia dalam larutan 3H timidin (0H adalah H yang bert disebut trimidin) dan sel dibiarkan mengalami replikasi satu kali, sel dimbil, dicuci dan kemudian ditutup denganfilm. Bila atom radiaktif rusak dan menimbulkan titik hitam pada film, berarti satu kromosom mempunyai label timidin radiaktif sedang yang lain tidak, yang menunjukkan adanya replikasi konservatif. Tetapi semua kromosom dengan label timidin akan menunjukkan adanya replikasi semi konservatif atau disfersif. Dengan membiarkn sel membelah satu kali pada timin yang diberi label, keudian dicuci diikuti dengan satu kali pembelahan sel dalam timidin tanpalabel maka akan terdapat kromosom dengan lalbel dan tanpa label, yang terlihat pada foto.dalam kenyataanya terlihat demikian dan ini membuktikan adanya replikasi semi konservatif.
Meselson dan stahl menggunakan teknik sentrifuge pada tahun 1958 untuk menentukan metode replicasi ADN. Teknik ini berdasrkan pengetahuan bahwa larutanseperti ADN apabila diputar dalam larutan yang sesuai misalnya cesium chlorida (CsCl) akan memisah pada tingkat kepekatan tertentu. Mereka menumbuhkan escerichia coli pada mediun N15 (nitrogen yang diberi label) sampai ADN menjadi berat.
8. Biosintesis ADN-Bagaimana Sel Mengatur Replikasi
Pada pita ADN, gugus fosfat melekat pada posisi 5’dari satu gugus gula dan pada posisi 3’ dari gugus gula didekatnya. Jadi satu pita dari spiral ganda mempunyai arah dari 5’ ke 3’, sedang pita yang lain arahnya berlawanan yaitu dari 3’ ke 5’. Hal ini disebut polaritas berlawanan.
9. Endonuklease
Suatu endonukleasi telah diketemukan, yang menyebabkan pitusnya pita ADN sehingga dapat memisah. Kedua pita ADN memisah sebagai persiapan untuk replikasi.
10. Struktur Adn dan Struktur Kromosom
ADN dapat dibuat in vitro dengan mencampur ADN dari organisme hidup sebagai catakan atau primer) dengan ADN saja (disebut ADN telanjang) dengan ADN polimerase nukleotida A, T, S, G. ADN barumempunyai urutan basa yangsama dengan ADN primer.
Penelitian mengenai replikasi ADN in vitro telah dilakkan dengan menggunakan kromosom prokariote yang hanyya terdiri dari ADN saja (disebut ADN telanjabg). Kromosomini telah diisolasi dan diamati dengan mikroskop elektron. Diameter dari pita kembar tepat untuk spiral ganda dari Watson-Crick yaitu 20-25 A0
11. Sinteti Protein
a. Gen dan Protein
1. Gen adalah urutan nukleotida tertentu dalam kromosom. Urutan nukleotida tersebut berbeda-beda untuk setiap gen dan menentukan urutan asam amino pada protein.
2. Protein adalah suatu molekul raksasa yang dibentuk dari asan amino yang mengikat satu dengan yang lain oleh ikatan peptida sehingga merupakan rantai panjang.
3. Sistron adalah bagian ADN yang memberi kode untuk satu rantai polipeptida. Namanya menunjukkan struktur gen yang lebih halus. Satu gen (sistron) memberi kode untuk satu protein atau ensim bila terbuat dari polipeptida tunggal. Beberapa protein (ensim) mempunyau dua rantau polipeptida. Jadi dua sistron diperlukan untuk memberikan kode.
12. Pengaturan Gen Pada Sintesis Protein
Aliran imformasi genetik dari kromosom (asam nukleat) sampai terjadi protein. Ini disebut central dogma diusulkan oleh Crick pada tahun 1958. Dengan kata lain ada urutan informasi dari ADN kepada ARN kemudian protein.
13. Bentuk-bentuk ARN
ARN – duta (Messenger RNA = m RNA) – menerima kode dari ADN dan membawanya ketempat sintesis protein ARN adalah pita tunggal dan panjangnya konstan untuk suatu gen tertentu tetapi berbeda untuk gen-gen yang berlainan.
ARN – Pemindah (Transfer RNA = t RNA) – terdapat dalam beberapa bentuk, masing-masing khusus untuk asam amino tertentu. Setiap macam ARN – pemidah di bentuk pada satu tempat tertentu pada kromosom, yaitu satu gen tertentu menghasilkan molekul ARN tertentu.
ARN – Ribosom (Ribosomal RNA = r RNA) – mem-bentuk bagian dari ribosom. ARN – ribosom dibuat pada lokasi tertentu pada kromosom yakni daerah nukleolus (nucleolar organizing region).
14. Transkripsi
1. Pembentukan ARN pada ADN cetakan
spiral ADN memisah tetapi hanya satu pita yang digunakan transkripsi ARN. Diperlukan suatu ensim ARN polimirase dalam pengaktifan basa-basa dan pemindahannya kepad cetakan ADN untuk transkripsi
2. Pembebtukan Pita ARN Duta
Satu spiral ganda ADN yang ditranskripsi dapat di gambarkan sebagai berikut ( satu bagian pendek dari satu pita)
3. Translasi
Translasi ini merupakan proses penterjemjemahan urutan nukleotida pada ARN-duta dan menghasilkan urutan asam mino dalam sintetsis protein. Translsi memburuhkan ARN-duta tetapi fungsinya yang tepat tidak diketahui
4. Translasi memerlukan ARN-pemindah
Molekul ARN-pemindah berbebtuk loop dan memindahkan asam amino dari sitoplasma kepda ribosom. Setiap ARN-pemindah memberikan satu ciri-ciri asam amino tertentu. Satu ujung dari ARN-pemindah yang berbentuk daun klofor / seperti semanggi (ujung 3’) merupakan tempat menerim asam amino tertentu.
2. Teknik Molekuler DNA
a. Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom. Pengetahuan mengenai aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen DNA. Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya.
b. Isolasi DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll. Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang terdiri dari
c. Elektroforesis DNA, Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.
d. Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa.
e. DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).
f. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA. Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama.
g. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik (Gambar 3).
h. Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.
i. Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4). Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.
j. Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp. Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb.
k. Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar 5).
l. Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer). Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya. Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi.
m. Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer. Sebagai contoh, hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks. Dalam hal ini, satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia. Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya. Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6.
n. Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan. Saat diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah. Mereka tampak ‘smear’. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA. Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat. Setelah DNA tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat. Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat.
o. Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop, maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 6).
p. Kloning DNA
Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.
q. Kloning DNA dalam plasmid vektor
DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli.
r. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu:
1. Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang.
2. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi
3. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
s. Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika.
t. Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7).
3. Kode Genetik
Hubungan antara urutan nukleotida pada ARN-pemindah (seperti yang ditentukan oleh ADN) dan urutan asam amino pada molekul protein. Kode genetik menentukan transformasi dari suatu urutan nukleotida menjadi urutan asam amino.
a. Kode Triplet
Kode genetik terdiri dari tiga pasang nukleotida yang berurutan atau satu triplet. Ini merukan kode yang mubasir (kelebihan) karena satu asam amino tertentu ditentukan lebih dari satu (triplet) penelitian-penelitian menunjukkan empat macam basa A, T, G, S, dengan kombinasi yang terdiri dari tiga basa dapat memberi kode dupuluh macam asam amino utama.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Geneika merupakan salah satu ilmu pengetahuan alam yang sangat menarik. Gen tersusun dari apa dan bagaimana gen-gen itu mengatur dan menampakan pengaruh yang kita lihat ADN mengandung informasi genetik dalam bentuk kode. Kode ini telah di terjemahkan dalam suatu model yang menggamabarkan bagai mana informasi tersebut berlangsung dari ADN dalam gen sampai pada protein dalam sel hidup
Saran
· Supaya kita dapat menjelaskan tentang bahan genetik !!!!
· Agar kita dafat berfikir ilmiah !!!
· Mualailah belajar !!!
DAFTAR PUSTAKA
· L. V. Crowder. 1997. Genetika Tumbuhan. Yogyakarta, Gadja Mada University Press
